实验原理

　　细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196~C液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂——终浓度5%~15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

　　目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

　　实验材料

　　仪器：MVE液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等

　　试剂：0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液)

　　附：冻存液配制：培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5-20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。

　　实验步骤

　　1.消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。

　　2.1000rpm离心10分钟，弃上清液。

　　3.沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

　　4.将悬液分至冻存管中，每管1ml。

　　5.将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

　　6.贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

　　7.按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。

　　注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。MVE液氮罐